Dados do Trabalho

Título

Caracterização bioquímica e purificação parcial de mureína endopeptidase em amostras intestinais de Rhodnius prolixus

Introdução

<p><em>Rhodnius prolixus</em>, vetor do <em>Trypanosoma cruzi</em>, agente da Doença de Chagas, mantém uma relação simbiótica com bactérias não patogênicas, fundamental em eventos fisiológicos. Análises genômicas do vetor identificaram o gene RPRC003168, possivelmente adquirido por transferência horizontal. Esse gene corresponde à mureína endopeptidase, uma metalopeptidase comum em bactérias gram-negativas, responsável por clivar a parede bacteriana.&nbsp;</p>

Objetivo (s)

<p>Determinar a atividade enzimática após filtração, após ciclos de congelamento e descongelamento, após inibição por sais e inibidores; purificar a mureína endopeptidase em amostras intestinais de <em>R. prolixus</em>.&nbsp;</p>

Material e Métodos

<p>Todos os ensaios foram realizados utilizando como amostra o intestino médio anterior de ninfas de quinto instar em diferentes dias após a alimentação. O órgão foi adicionado a 100uL de solução salina 0,9% (p/v), homogeneizado, centrifugado e o sobrenadante foi coletado. As amostras foram ensaiadas com<em> Mycrococcus lysodeikticus</em> 0,0015% (p/v). No ensaio de filtração foi adicionado 200uL de solução salina 0,9% (p/v) ao tecido. As amostras foram filtradas em filtro de 0,22 micrômetros. Para avaliar a inibição enzimática por sais foram adicionados NaCl, KCl e Na2SO4 em concentração final de 250mM. O ensaio com inibidores de protease foi realizado com os inibidores E64, pepstatina A, PMSF, fenantrolina em altas concentrações finais.&nbsp; Para a purificação foi realizada uma Cromatografia em AKTA-FPLC de filtração em gel em coluna Superdex 75 10/300 GL. A amostra foi filtrada em filtro de 0,22 micrômetros. As frações foram ensaiadas com <em>M. lysodeikticus</em> 0,0015% (p/v). As frações com maior atividade foram quantificadas. Após, foi realizada a precipitação com TCA e aplicação em gel de poliacrilamida 12%. Experimentos realizados sob CEUA/IOC – 033/2018.</p>

Resultados e Conclusão

<p>A atividade enzimática após filtração permaneceu. Ademais, a atividade enzimática resistiu à inibição por sais ou inibidores de protease. Em gel de poliacrilamida, foi identificada uma proteína de peso molecular de 39KDa, semelhante à enzima de <em>Escherichia coli&nbsp;</em>e&nbsp;distinta das enzimas conhecidas de <em>R. prolixus</em> e das proteínas de coelho provenientes da alimentação.&nbsp;Foi possível esclarecer a etiologia da atividade enzimática através da filtração e descartar a participação em grande escala de outras classes de protease. A partir da purificação prévia foi possível identificar o peso molecular de uma enzima incomum, provavelmente mureína endopeptidase.&nbsp;</p>

Palavras Chave

bioquímica; enzimologia; mureína endopeptidase; purificação; Rhodnius prolixus